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慢病毒構建穩轉細胞系——艾柏森生物

更新時(shí)間:2024-06-18點(diǎn)擊次數:156


 

慢病毒(Lentivirus)是一種逆轉錄病毒,屬于慢病毒屬,其特點(diǎn)是能夠感染分裂和非分裂的細胞,并且具有較長(cháng)的潛伏期。慢病毒載體因其高效的轉導效率和較低的免疫原性,被廣泛應用于基因治療和生物醫學(xué)研究中。構建慢病毒穩轉細胞系是現代生物技術(shù)研究中的一個(gè)重要步驟,以下是構建慢病毒穩轉細胞系的一般步驟:

 

目標基因的選擇與克?。菏紫?,需要確定你想要穩定表達的目標基因,并將其克隆到慢病毒載體中。慢病毒載體通常包含啟動(dòng)子、目的基因表達框、polyA信號等元件。

 

載體構建:將目標基因克隆到慢病毒載體中,構建重組慢病毒載體。這通常涉及到限制性?xún)惹忻盖懈?、連接酶連接等分子克隆技術(shù)。

 

共轉染產(chǎn)生病毒顆粒:將重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒(如gag/pol、rev、vsv-g等)共轉染到宿主細胞中,如HEK293T細胞,以產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒。

 

病毒顆粒的收集與濃縮:轉染后48-72小時(shí),收集含病毒顆粒的培養基,通過(guò)超速離心等方法進(jìn)行濃縮,以提高病毒滴度。

 

病毒感染細胞:將濃縮的病毒顆粒與目標細胞共培養,使病毒整合到宿主細胞基因組中??梢酝ㄟ^(guò)觀(guān)察綠色熒光蛋白(GFP)等報告基因的表達來(lái)評估感染效率。

 

篩選穩轉細胞:感染后,通過(guò)抗生素篩選(如嘌呤霉素、新霉素等)或其他篩選標記,篩選出穩定表達外源基因的細胞克隆。

 

單克隆培養:將篩選出的穩轉細胞進(jìn)行限制稀釋?zhuān)纬蓡慰寺?,以確保細胞群體的均一性。

 

擴增與鑒定:對單克隆細胞進(jìn)行擴增培養,并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,如PCR、Western blot等,以確認目標基因的整合和表達。

 

功能研究:利用構建好的穩轉細胞系進(jìn)行后續的功能研究,如藥物篩選、信號通路分析、疾病模型建立等。

 

長(cháng)期保存:將穩轉細胞系凍存于液氮中,以備后續使用。

構建慢病毒穩轉細胞系是一個(gè)復雜的過(guò)程,需要精確的實(shí)驗設計和嚴格的實(shí)驗操作。此外,由于慢病毒的潛在致病性,實(shí)驗過(guò)程中還需遵循相關(guān)的生物安全規范。通過(guò)這一過(guò)程,研究人員可以獲得穩定表達特定基因的細胞模型,為疾病機理研究和藥物開(kāi)發(fā)提供重要的實(shí)驗工具。

 


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